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植入前因子在人子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中调节滋养层的侵袭GydF4y2Ba

摘要GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

成功的人类胚胎植入需要子宫内膜基质细胞(ESCs)分化为蜕膜细胞,这一过程称为蜕膜化。ESCs表达蜕膜化的特异性标志物,包括催乳素、胰岛素样生长因子结合蛋白-1 (IGFBP-1)和连接蛋白-43。蜕膜细胞也通过分泌多种因子控制滋养层的侵袭,如基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶的组织抑制剂。着床前因子(PIF)是最近发现的一种胚胎衍生肽,在胎儿-母体界面具有活性。它在人子宫内膜中创造了良好的促炎环境,通过增加人滋养细胞入侵子宫内膜的能力,直接控制胎盘的发育。我们假设PIF对子宫内膜的作用抵消了其前侵袭作用。GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba

我们采用RT-qPCR和/或免疫化学发光法检测sPIF对三种蜕膜化标记物表达的影响。通过体外创面愈合实验,我们检测了sPIF对人体ESC迁移的影响。我们通过酶谱和侵袭实验分析了sPIF对子宫内膜控制人滋养细胞侵袭的影响。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

首先,我们发现PIF(SPIF)的合成模拟显着上调IGFBP-1和Connexin-43的mRNA表达,并在ESC的催乳素分泌 - 表明Pro分化效应。其次,我们表明,HTR-8 / Svneo滋养细胞系侵入能力在与SPIF培养的ESC的条件培养基存在下很低。第三,这种PIF的抗侵入动作与MMP-9活性的特异性降低有关。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的结果表明,PIF突出了脱携程和限制滋养细胞侵袭的子宫内膜因子的产生。通过控制滋养细胞和子宫内膜细胞,因此PIF因此似乎是人胚胎植入过程中的枢转播放器。GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

人体胚胎植入是一种多步骤过程,首先从滋养胚性对母体子宫内膜的滋养细胞的链接开始。在“植入窗口”期间发生这种联系 - 短时间的子宫接受,对应于月经周期的中间分泌阶段[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba].在胚泡上附着在子宫内膜上皮后,其外形滋养细胞(EVTS)渗透到子宫内膜基质中并获得侵入性表型 - 导致子宫内膜中的胎盘锚定[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

在滋养层侵袭过程中,EVTs分泌大量基质金属蛋白酶(MMPs) [GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba].MMP-2和MMP-9的作用对于滋养流侵犯至关重要[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba].实际上,这些明胶酶能够降解子宫内膜细胞外基质(ECM)的主要成分,即胶原蛋白IV。MMP活性的水平由金属蛋白酶(TIMP)的特定组织抑制剂调节,其与1:1化学计量的结合和灭活MMP [GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba].因此,正确调控EVTs中MMP/TIMP平衡对胚胎成功植入至关重要[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba].滋养细胞的侵袭也需要足够的子宫内膜容受性[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba].其特征是形态、生化和血管的变化,包括(i)上皮pinopods的出现,(ii)细胞因子、生长因子和粘附分子的调节表达(特别是αv-和β3整合素的上调和粘蛋白1和粘蛋白12在子宫内膜上皮细胞中的消失),(iii)子宫内膜基质细胞(ESCs)的蜕膜化。蜕化发生在对卵巢激素17β-雌二醇(E2)和孕酮(P4)的反应中。它伴随着催乳素和胰岛素样生长因子结合蛋白1 (IGFBP-1)的分泌,以及缝隙连接连接蛋白43 (CX-43)在人ESCs中的表达[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba].还观察到蜕膜ECM重塑事件。这些过程与MMP-2,-9分泌和调制相关联GydF4y2BaTIMP-1 2GydF4y2Ba人体ESC中的基因表达[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba].这种类型的ECM重塑增强了ESC运动,从而促进了滋养细胞浸润到子宫内膜基质[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba].蜕膜ECM重塑是一种复杂的过程,其被胎盘和蜕膜细胞产生的内在因素紧密控制[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba].例如,人绒毛膜促性腺激素、肿瘤坏死因子α (TNF-α)和脂联素通过增强子宫内膜MMP-2、-9活性和抑制子宫内膜TIMP-1分泌促进EVT迁移[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba].相反,抗菌抗生素trichostatin A通过增加ESCs产生TIMP-1、-3和降低子宫内膜MMP-2、-9的活性来限制滋养层的侵袭[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba].因此,侵袭部位的局部MMP/TIMP平衡需要滋养细胞和ESCs之间适当的相互作用。总之,蜕膜化和蜕膜ECM重构的机制是复杂的,尚未明确阐明。GydF4y2Ba

在这里,我们专注于预体因子(PIF)及其在成功,可行的怀孕中的作用。该因子仅是由可行胚胎分泌的小肽,并且存在于母体循环中直至术语[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba].PIF也由胎盘表达[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba].Mondjie等人。最近据报道,在怀孕的最早阶段的滋养细胞中的PIF表达突出,然后在术语中下降[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba].PIF的主要效果对于怀孕的启动和维护至关重要,促进培养的胚胎的发展,(ii)作为毒性血清诱导的胚胎消亡的救援因子[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba], (iii)调节系统免疫以促进胚胎耐受性,同时保留母亲对抗病原体/疾病的能力,并消除自然杀伤细胞诱导的毒性[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba, (iv)通过p53信号通路减少滋养层细胞凋亡[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]而且,(v)增强滋养细胞侵犯[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba].关于最后一点,已经描述了PIF在外形滋养细胞中的促侵入作用似乎通过不同的信号通路介导,例如丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK),磷酸膦酸碱基-3-激酶(PI3K),Janus-kinase信号传感器和转录(JAK-STAT)信令路径[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba].此外,两项研究表明,PIF通过调节产物涉及炎症,粘附和凋亡的基因,PIF可以促进子宫内膜受损,并通过促进免疫调节配体的分泌和某些激酶的磷酸化作为MAPK,以激活子宫环境[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba].作为一个整体,这些数据强烈表明PIF在胚胎植入中具有至关重要的作用。然而,PIF对人体ESC的蜕膜化影响的分子机制尚未完全表征。GydF4y2Ba

在此背景下,本研究的主要目的是明确PIF在着床窗口期对人类子宫内膜的影响,以便更好地理解在妊娠早期建立的胚胎-母体对话。为此,我们研究了人工合成的PIF (sPIF)在50 nM时对人ESC蜕膜化程序和子宫内膜对滋养层侵袭的控制。之所以选择这个浓度,是因为PIF在孕妇循环中以50 - 150ng /ml (30 - 100nm)浓度存在[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba], sPIF在相同浓度范围内可以有效地调节几种蜕膜细胞功能[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

材料和方法GydF4y2Ba

材料GydF4y2Ba

D.ulbecco’s Modified Eagle’s Medium and Ham F-12 Nutrient Mix (DMEM/F12), Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, progesterone, E2, penicillin, streptomycin, DNase type I, and bovine serum albumin were purchased from Sigma Chemical Co (Saint Louis, MO, USA). Fetal calf serum (FCS) was purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). The sPIF (purity: 95%, as documented by HPLC and mass spectrometry) was produced by Biosynthesis (Lewisville, TX, USA). Superscript III RNase H-RT and primers were from Invitrogen, and RNase inhibitor was obtained from AMRESCO (Solon, OH, USA). The Nucleospin RNA II kit was obtained from Machery-Nagel (Düren, Germany). Trypsin was provided by Difco Laboratories (Detroit, MI, USA). Matrigel® was obtained from BD Biosciences (Le Pont-de-Claix, France) and collagenase A was from Boehringer (Mannheim, Germany). The selective, irreversible PI3K inhibitor wortmannin was purchased from Sigma Chemical Co. The suppliers of the various antibodies used here are described in the corresponding paragraphs below.

研究人口和组织收集GydF4y2Ba

研究总共34名常循环妇女(平均值±标准偏差:33.6±0.5),在该研究中纳入生育评估的活检。通过在植入窗口(自发卵巢循环的第20-25天)的管毛(Pipelle deCornier®,法国)中获得子宫内膜组织。排除了诸如隐性纤维瘤或息肉的存在的解剖学异常的妇女,或者在肺癌期间的低端膜厚度(<7mm)。纳入标准还包括良好的荷尔蒙储备和对卵巢刺激的正常反应。实际上,我们所有的研究人群都有FSH≤8μL/ mL,E2≤40pg/ ml,≥1.5ng/ ml的荷尔蒙测定,以及滤泡相的第3天≥1.5ng/ ml和嗜烟卵泡计数≥12。该研究得到了当地调查审查委员会的批准(GydF4y2BaComitéConsultatifDe Presence des Personnes Dans La RechercheMédicale,批准参考协议01-78GydF4y2Ba), 法国巴黎;参考:01-78)。所有参与者在组织抽样之前提供了他们的书面知情同意书。GydF4y2Ba

人类ESC文化GydF4y2Ba

如González和同事所述,人类ESCs被分离和培养[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba].简而言之,将组织样品剁碎成小块并在两步法中消化。将组织在37℃下在含有胶原酶(0.1%),DNase I(0.005%),青霉素(10μg/ ml)和链霉素(100u /ml)。将上清液通过100μm尼龙筛过滤,然后在200℃下离心 GGydF4y2Ba10分钟。在含有胰蛋白酶(0.25%)的DMEM / F12培养基中,在37℃下对未消化的组织进行第二种酶消化10分钟(0.25%),DNase I型(0.1%),EDTA(0.03%),青霉素(10μg/ ml),和链霉素(100u / ml)。将消化的组织通过40μm尼龙筛过滤,然后在200℃下离心 GGydF4y2Ba10分钟。将来自两种消化的细胞颗粒合并并在200时离心 GGydF4y2Ba10分钟。GydF4y2Ba

在5%CO中培养在补充有链霉素(10μg/ ml),青霉素(100u / ml),青霉素(100u / ml)和Fcs(10%)的DMEM / F12培养基中培养细胞。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba95%是大气。当细胞汇合时,在含有DMEM/F12和E2 (10GydF4y2Ba- 8GydF4y2Ba M), P4 (10- 6GydF4y2BaM)、炭剥FCS(2%)、青霉素(10 μg/mL)和链霉素(100 U/mL)作用2周。如前所述,培养基每2天更换一次[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

HTR-8/SVneo细胞与esc条件培养液共培养的侵袭实验GydF4y2Ba

滋养层细胞对esc分泌分子的侵袭性评估使用HTR-8/SVneo永生化EVT细胞系(由Nadia Alfaidy博士(CEA Grenoble, France)提供,并与加拿大安大略省皇后大学的Charles H. Graham博士达成一致)。HTR-8/SVneo细胞在含有HEPES 1 M(2%)、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 μg/mL)和FCS(10%)的RPMI培养基中培养,直至融合。根据Tapia-Pizarro及其同事所描述的修改方案,入侵检测采用24孔板,包含Matrigel®涂层聚碳酸酯膜(孔径:8 μm)入侵腔插入物(Greiner Bio-One SAS, Courtaboeuf,法国)。然后悬浮HTR-8/SVneo细胞(5 × 10GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba从15天蜕皮化的ESC(或不)用SPIF(50nM)处理的250μl条件培养基(cm)中的250μl条件培养基(cm)。为了验证我们的实验条件,含有E2的媒体(10GydF4y2Ba- 8GydF4y2Ba(10 .GydF4y2Ba- 6GydF4y2Ba M) in the absence or presence of two positive controls i.e. FCS (10%) or adiponectin (250 ng/ml) were used as controls. RPMI medium supplemented with FCS (10%) was added to the lower well as a chemoattractant. After 48 h of incubation at 37 °C, medium containing non-invading cells was removed from the upper well. Invasive HTR-8/SVneo cells at the lower surface of the insert were washed and fixed with paraformaldehyde (4%) for 30 min. The nuclei were counterstained with 1 μg/mL Hoechst reagent and visualized with an inverted laser scanning confocal microscope (Leica white light laser TCS SP8-X, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). On each insert, invasive cells were counted on five randomly selected fields by using the post-imaging procedure in ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Invasive cells were defined as those whose nucleus exceeded 8 μm (i.e. the pore size).

体外伤口愈合测定GydF4y2Ba

ESCs按1 × 10播种GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba细胞/ cm.GydF4y2Ba2GydF4y2Ba.在含有卵巢激素(E2在10GydF4y2Ba- 8GydF4y2Ba M and P4 at 10- 6GydF4y2Ba M), cell layers were wounded with a blade and washed three times with serum-free culture medium. The mark left by the blade on the plastic served as the migratory start line. Digital photographs of 6 different regions of each wound were taken before and 24 h after sPIF addition to serum-free culture medium. Cells that had migrated and repaired the wounded area were quantified using ImageJ software by measuring the width of the wound (mm/24 h) for each condition (in the presence of absence of sPIF).

Zymograph..GydF4y2Ba

在培养15天后,在含有卵巢激素的分化培养基中的缺失或存在的缺失或存在下,含有SPIF(50nm)(E2GydF4y2Ba- 8GydF4y2Ba M and P4 at 10- 6GydF4y2Ba M), total gelatinase activities from ESCs were analyzed by zymography. Aliquots of CM containing 60 μg of protein were resolved under non-reducing conditions in 10% polyacrylamide gels containing 1 mg/mL gelatin (Difco). Gels were washed in Triton X-100 (2.5%) for 30 min to remove SDS and incubated overnight at 37 °C in renaturing buffer (50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 5 mM CaCl2GydF4y2Ba,150mM NaCl和0.02%叠氮化钠)。用Coomassie辉煌的蓝色染色凝胶,居住在甲醇/乙酸(20%/ 5%v / v)中。蛋白水解活性被鉴定为蓝色背景上的透明带。扫描图像,使用imagej软件量化频段强度。GydF4y2Ba

逆转录 - 定量聚合酶链反应(RT-QPCR)GydF4y2Ba

将ESC接种到12孔培养板中(3.5×10GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba每孔细胞)。在含有卵巢激素的分化培养基中存在或不存在的分化(D3,D8,D15)的3,8或15天(D3,D8,D15)后(E2为10GydF4y2Ba- 8GydF4y2Ba M and P4 at 10- 6GydF4y2BaM),提取ESCs总RNA (0.1 μg)并逆转录,如前所述。RT-qPCR采用C1000 Thermal Cycler (CFX96实时系统;BioRad, Hercules, CA, USA)和表中所示的引物集GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.引物的最终浓度为25μm。编码核糖体蛋白L13A的三种参考基因(GydF4y2Barpl13a.GydF4y2Ba)、TATA盒结合蛋白(GydF4y2BaTBP.GydF4y2Ba如前所述,选择β2-微胶质蛋白[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba].对于每个样本,使用BioRad CFX Manager软件(3.0版)计算浓度比(目标/三个参考mrna),并以任意单位表达,如前所述[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

表1用于RT-PCR的引物GydF4y2Ba

催乳素分泌GydF4y2Ba

使用自动免疫化学荧光测定系统(ALINITILE®,雅培,跑道,法国)测量培养培养基中的催乳素分泌物。为了比较催乳素分泌的水平,结果每1μg总蛋白质标准化。根据Bradford的方法测量蛋白质浓度,牛血清白蛋白作为标准。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

在5至13个单独的实验中对原始数据进行统计分析。非参数化的配对Wilcoxon试验用于比较(i)D3和D15在D3和D15的情况下的控制情况(在没有SPIF的情况下),并且(ii)50nm spif与给定时间点的控制情况的影响。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

sPIF对人体ESC脱屑作用的影响GydF4y2Ba

PRL,IGFBP-1,GydF4y2Ba和GydF4y2BaCX-43GydF4y2BamRNA表达和催乳素分泌作为sPIF对蜕膜化影响的生物标志物。在验证了我们的体外分化方案(即观察到mRNA表达显著增加GydF4y2BaPRL.GydF4y2Ba那GydF4y2BaIGFBP-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCX-43GydF4y2Ba在ESC DeCInualization过程中;分别在D15分别在11-,100-和1.5倍的相对增加)(图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaA-C),我们研究了SPIF对这一过程的影响。如图1所示。GydF4y2Ba1GydF4y2BaB-C,我们发现了GydF4y2BaIGFBP-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCX-43GydF4y2BasPIF在D3、D8、D15时mRNA表达显著增加。为GydF4y2BaPRL.GydF4y2BamRNA表达,仅在D8时观察到这种上调作用(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba此外,我们观察到在D11、D13和D15时,sPIF (50 nM)的催乳素分泌显著增加(分别增加了1.5、1.4和1.3倍)(图)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bad)。与较高的SPIF浓度为100nm(1.7±0.4倍)(数据未显示)获得相似的ESC催乳素分泌的结果。因此,我们在以下实验中决定使用50 nm的spif。GydF4y2Ba

图1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

SPIF对人体ESC蜕皮病的影响。在补充有E2,P4和(在一些实验中)50nm Spif的DMEM / F12培养基中培养人体ESC。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba-GydF4y2BaCGydF4y2Ba三(D3),8(D8)和15天(D15)的细胞蜕皮化后提取总RNA。mRNA表达水平GydF4y2Ba催乳激素GydF4y2Ba(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba),GydF4y2BaIGFBP-1GydF4y2Ba(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba),GydF4y2Baconnexin-43GydF4y2Ba(GydF4y2BaCGydF4y2Ba)采用RT-qPCR进行定量,方法见材料与方法部分。数据以6 ~ 10次独立实验的平均值±SEM表示。GydF4y2BaD.GydF4y2Ba如材料和方法中所述,在3天(D3),8天(D8)和15天(D15)后测量催乳素分泌到子宫内膜上清液中。数据显示为平均±SEM为8至13个单独的实验。D3,D5,D8,D11,D13上的控制值分别为46.5±8.7,130.7±22.5,346±110,419±105,494.5±77和676.4±102mIu / g蛋白。*:GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05;**:GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.01;***:GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.001 (Wilcoxon test); (a) Prolactin secretion in presence of sPIF vs. the control (lacking sPIF); (b) Prolactin secretion at D15 vs. D3 for control experimental condition (lacking sPIF)

PI3K途径参与SPIF的亲差异效果GydF4y2Ba

为了深入了解人体ESC的PIF诱导的蜕皮化的分子机制,我们对PI3K信号通路的选择性抑制剂进行了进一步的实验。如图2所示。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,Wortmannin施加了一个显着的影响GydF4y2BaIGFBP-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCX-43GydF4y2BamRNA表达水平。此外,我们表明,当PI3K途径被抑制时,SPIF的Pro分化效果不会消除。GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
figure2GydF4y2Ba

PI3K抑制剂对spif增强ESC蜕层化的影响人ESCs在含有E2、P4和PI3K抑制剂wortmannin (10 μM)的DMEM/F12培养基中培养15天,sPIF存在或不存在(50 nM)。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba-GydF4y2BaB.GydF4y2Ba在15天(D15)的细胞蜕皮化后,提取总RNA。mRNA表达水平GydF4y2BaIGFBP-1GydF4y2Ba(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba),GydF4y2Baconnexin-43GydF4y2Ba(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba)采用RT-qPCR进行定量,方法见材料与方法部分。数据显示为平均±SEM为4至11个单独的实验。*:GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05;**:GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.005 (Wilcoxon test). (a) sPIF vs. control (lacking sPIF); (b) wortmannin vs. control (lacking sPIF); (c) sPIF vs. sPIF + wortmannin

Spif在子宫内膜运动中的参与GydF4y2Ba

我们使用了伤口修复试验来检查SPIF改变人体ESC的迁移性质的能力。如图1所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,在暴露于SPIF后,在我们的实验条件下,在我们的实验条件下进入裸露区域的剥离区域略微下降(18%)15天。GydF4y2Ba

图3GydF4y2Ba
图3GydF4y2Ba

SPIF对人ESC运动的影响。在补充有E2,P4和(在一些实验中)50nm Spif的DMEM / F12培养基中培养人体ESC。如材料和方法所述,在伤口后分析卷绕宽度为0和24小时。卷绕宽度数据表示为5个单独的实验的平均值±SEM。*:GydF4y2BaP.GydF4y2BasPIF与对照(缺乏sPIF)的Wilcoxon检验< 0.05GydF4y2Ba

Spif在滋养细胞侵袭中的子宫内膜控制中的参与GydF4y2Ba

为了确定SPIF如何参与滋养细胞侵袭的子宫内膜控制,我们进行了Matrigel®Rourtwell侵袭测定。我们在CM存在下通过将eSCS处理(或不)与SPIF(50nm)分化为15天(图3)来培养HTR-8 / SVNEO的HTR-8 / SVNEO细胞系(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种)。如图1所示。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaB和C,我们发现,具有Cm的培养物来自Spif处理的ESC的培养物与HTR-8 / Svneo细胞的侵入性活性显着降低(32%)。在我们的实验条件下,FCS(10%)和脂联素(250ng / ml)用作EVT侵袭的阳性对照。GydF4y2Ba

图4GydF4y2Ba
装具GydF4y2Ba

Spif在ESC的滋养细胞侵袭子宫内膜控制中的参与。PIF改善了滋养化迁移的子宫内膜控制。GydF4y2Ba一种GydF4y2BaHTR-8/SVneo细胞的Transwell迁移实验如材料和方法所述。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba代表性的12个独立实验的显微照片显示固定和DAPI染色的HTR-8/SVneo细胞位于跨孔膜的底部。HTR-8/SVneo细胞在对照条件(a)或50 nM sPIF条件(b)中暴露15天的条件培养基(CM)中培养。GydF4y2BaCGydF4y2BaHTR-8 / Svneo细胞在厘米的情况下悬浮在CM的存在下,在SPIF(50nm)的存在或不存在下或在对照培养基的存在下或在对照培养基存在下,补充或不含FCS 10%或脂肪蛋白(250 ng / ml)。数据显示为3-12个单独实验的平均值±SEM。***:GydF4y2BaP.GydF4y2BasPIF与对照(缺乏sPIF)的Wilcoxon检验< 0.001GydF4y2Ba

sPIF对子宫内膜MMP活性的影响GydF4y2Ba

我们下次试图指定SPIF的抗侵袭动作所涉及的分子机制。酶谱测定揭示了两个带,对应于在细胞培养的D15上收集的MMP-2(72kDa)和MMP-9(92kDa)的凝胶酶活性。如图1所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA和B, sPIF治疗与显著降低D15 MMP-9活性相关(−57%)。然而,在我们的实验条件下,我们没有观察到sPIF对MMP-2活性的任何影响。GydF4y2Ba

图5GydF4y2Ba
figure5GydF4y2Ba

sPIF对子宫内膜TIMP mRNA表达及MMP活性的影响在补充有E2,P4和(在一些实验中)50nm Spif的DMEM / F12培养基中培养人体ESC。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba在存在或不存在sPIF (50 nM)的情况下,暴露15天,CM中明胶酶(MMP-9和MMP-2)的活性如材料和方法所述。这个图显示了11个独立实验的一个代表。GydF4y2BaB.GydF4y2BaGelatin酶谱的定量结果对MMP-2和MMP-9活性。数据显示为平均±SEM为5至8个单独的实验。GydF4y2BaCGydF4y2Ba细胞分化15天后提取总RNA。mRNA表达水平GydF4y2BaTIMP-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaTIMP-2GydF4y2Ba通过RT-QPCR量化,如材料和方法中所述。数据显示为11个单独的实验的平均值±SEM。**:GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.005 (Wilcoxon test) for sPIF vs. the control (lacking sPIF)

sPIF对子宫内膜TIMPs mRNA表达的影响GydF4y2Ba

最后,我们关注了侵袭抑制剂TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达,这两种抑制剂在人子宫内膜中均有强表达。RT-qPCR检测未发现任何显著变化GydF4y2BaTIMP-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaTIMP-2GydF4y2Ba在sPIF作用下培养15天后mRNA的表达量(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC)。GydF4y2Ba

讨论GydF4y2Ba

早期建立母形串扰对于怀孕的进展至关重要。许多母亲和胎儿因素在植入和超越期间具有重要作用。在本研究中,我们研究了PIF - 一种专门由患者胚胎分泌的小肽的作用 - 对脱胆过程和滋肾血管侵袭的子宫内膜控制。GydF4y2Ba

我们通过测量蜕膜化标记物如泌乳素、IGFBP-1和连接蛋白43的mRNA表达来评估ESC分化。我们观察到D3和D15之间所有三种标记物的表达对分化培养基的响应显著上调——表明ESCs在D15完全分化。这些结果与文献中关于E2和P4存在时ESC体外分化的数据一致[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba].接下来我们研究了sPIF对ESC脱屑的影响。我们目前的结果清楚地表明,sPIF增加了ESC生化蜕化,这是由sPIF处理的ESCs的催乳素分泌显著增加所证明的。这种上调效应似乎与PIF的作用有关GydF4y2BaPRL.GydF4y2Ba基因转录。但是,PIF的暂时效应GydF4y2BaPRL.GydF4y2BamRNA的表达也与对催乳素蛋白的更持久的作用有关,这表明PIF影响了催乳素蛋白的稳定性GydF4y2BaPRL.GydF4y2BamRNA。RNA和蛋白质水平之间的对应性并不令人惊讶,并且已经在文献中描述了[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba].更具体地说,两项不同的研究,包括我们实验室之前的一项研究,清楚地证明了催乳素mRNA表达和激素释放之间的不匹配[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba].我们还证明了Spif上调GydF4y2BaIGFBP-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCX-43GydF4y2Ba在ESC分化过程中mRNA的表达,从而加重了人ESCs的蜕化。我们的结果与之前的基因组和蛋白质组学研究一致,PIF通过下调一个与人类子宫内膜容受性相关的基因,即磷酸二酯酶4B编码基因,从而促进子宫内膜容受性。事实上,这种酶专门水解cAMP,一种脱屑化的关键启动子[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

许多信号通路参与了人类ESC脱屑过程。此外,我们之前报道过PIF在滋养细胞中的作用(至少部分)是由PI3K信号通路介导的[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba].因此,为了进入参与PIF诱导的Drocualization的分子机制的见解,我们研究了PI3K信号通路。我们首先表明,特定的PI3K抑制剂Wortmannin本身上调GydF4y2BaIGFBP-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCX-43GydF4y2Ba转录。这些结果并不意外,因为它们与先前对人体基质细胞的研究一致,其中子宫内膜分化中对PI3K途径的抑制是决定性的[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba].其次,我们的结果表明,SPIM的生物引入效应似乎不被PI3K途径介导。我们目前正在寻求确定另一种信号传感器(Janus-Kinase信号传感器和转录激活剂)的可能参与PIF对DeCanization过程的控制。我们以前在我们的实验室中证明了PIF通过刺激包括JAK-STAT转导的不同信号通路来促进人滋养管侵犯[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba].此外,两项全基因组转录组变化研究表明,ESCs的蜕化是一个多相过程,涉及不同的转录程序,包括JAK-STAT转导[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba].最后,已经描述了转录因子STAT3似乎在解脱过程中发挥着关键作用[GydF4y2Ba40.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

我们的实验还证明了SPIF下调了减少细胞的流动性。因此,PIF通过促进其分化并抑制其迁移,对子宫内膜基质细胞产生旁静脉作用。已经在人体中的另一个分泌的蛋白质(原素1)中描述了类似的作用[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba].因此,本研究突出了胚胎肽PIF在子宫内膜接受中的累及。GydF4y2Ba

蜕膜化的基质细胞也控制滋养细胞侵袭[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba].因此,我们决定确定sPIF是否能够改变蜕化ESCs调节这一过程的能力。我们的结果清楚地表明,在sPIF条件下培养2周的ESCs能显著降低滋养层的侵袭。为了在分子水平上获得更多的信息,我们接下来研究了sPIF对人ESCs中MMP活性和TIMP mRNA表达的影响。我们的数据表明,sPIF与ESCs中MMP-9活性低显著相关,而与TIMP表达无差异。这些发现表明PIF可以调节子宫内膜因子的产生,这些因子已被描述为人类滋养细胞侵袭的负调控因子(如转化生长因子β (TGFβ)家族成员和干扰素-γ) [GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba].目前很难说PIF是直接控制子宫内膜因子分泌还是间接作用。GydF4y2Ba

先前已经描述了SPIF通过在子宫内膜上皮细胞中促进α2β3整联蛋白,临界植入标志物的表达来施加促进效果[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba].在本文中,我们展示了Spif在ESC中发挥了典型的作用。所有这些结果表明PIF可以被认为是子宫内膜功能的关键调节因子。GydF4y2Ba

有趣的是,我们在本文中证实了sPIF通过分泌子宫内膜因子间接降低了人滋养细胞的侵袭能力。相比之下,我们之前的研究表明sPIF直接增加了人滋养细胞的侵袭能力[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba].因此,同样的分子,即sPIF,似乎通过在胎盘和子宫内膜中分别维持前侵润信号和抗侵润信号,对人类滋养层的侵润能力发挥双重控制作用。PIF对蜕膜细胞和滋养层细胞的双重控制可能会限制细胞的迁移,从而避免过度的滋养层侵袭。胎盘侵入失调与一些妊娠疾病有关,如子痫前期和宫内生长受限,这一点已经得到了很好的证实[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba].我们的实验室先前据报道,受先兆子痫或宫内生长限制影响的妊娠的胎盘PIF蛋白水平明显低于妊娠期匹配对照[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba].我们的结果表明,PIF对人胎盘和子宫内膜的特异性效果通过特异性调节滋养板的侵入能力来影响这些病态的发作。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

总之,我们的数据表明,PIF在建立人体胚胎植入方面具有关键作用I)增加了ESC和II的蜕膜化的蜕皮病,限制了滋养细胞侵袭。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

在合理的要求下,可以从作者处获得文献搜索结果。GydF4y2Ba

缩写GydF4y2Ba

CM:GydF4y2Ba

条件培养基GydF4y2Ba

CX:GydF4y2Ba

Connexin.GydF4y2Ba

DMEM / F12:GydF4y2Ba

杜尔贝科改良的老鹰培养基和F-12火腿营养混合物GydF4y2Ba

E2:GydF4y2Ba

17β雌二醇GydF4y2Ba

ECM:GydF4y2Ba

细胞外基质GydF4y2Ba

退出:GydF4y2Ba

子宫内膜基质细胞GydF4y2Ba

EVT:GydF4y2Ba

Extravillous滋养层GydF4y2Ba

FCS:GydF4y2Ba

胎牛血清GydF4y2Ba

IGFBP-1:GydF4y2Ba

胰岛素样生长因子结合蛋白1GydF4y2Ba

Map Kinase:GydF4y2Ba

促丝糖型活化蛋白激酶GydF4y2Ba

MMP:GydF4y2Ba

基质金属蛋白酶GydF4y2Ba

P4:GydF4y2Ba

黄体酮GydF4y2Ba

PI3K:GydF4y2Ba

磷脂酰肌醇3激酶GydF4y2Ba

PIF:GydF4y2Ba

预体因子GydF4y2Ba

光杆载荷:GydF4y2Ba

催乳素GydF4y2Ba

RPMI:GydF4y2Ba

罗斯威尔公园纪念研究所GydF4y2Ba

TGFβ:GydF4y2Ba

转化生长因子GydF4y2Ba

TIMP:GydF4y2Ba

金属蛋白酶组织抑制剂GydF4y2Ba

肿瘤坏死因子-α:GydF4y2Ba

肿瘤坏死因子αGydF4y2Ba

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下载参考GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

作者感谢Chi de Poissy-Saint-Germain-en-Laye的妇科和妇产科部的工作人员,用于提供人体子宫内膜组织的样品。免疫荧光图像采集和分析是在Cymages设施进行的,由圣昆汀城市社区和Versailles-Saint-Quentin-en-yvelines资助。我们感谢BenoîtMaury用于分析共聚焦显微镜数据的技术援助。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

这项工作是由Santé de la Femme研究所(总部设在Santé的凡尔赛大学的科学)和Maternité et Médecine de la生殖协会(总部设在中心医院的poissey - saint Germain)资助的。GydF4y2Ba

作者信息GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

EDS和MND设计了实验。KF为实验提供了人的子宫内膜活组织检查。PL,HM和LA进行了实验。EDS和MND分析了数据并写了稿件。VS分析了RT-QPCR数据。Fv获得了研究资金,并批判性修订了手稿。Spif是来自EB的礼物。作者读并批准了最终的稿件。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2BaMarie-Noelle DieudonneGydF4y2Ba.GydF4y2Ba

伦理宣言GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

该研究得到了当地调查审查委员会的批准(GydF4y2BaComitéConsultatifDe Presence des Personnes Dans La RechercheMédicale,批准参考协议01-78GydF4y2Ba), 法国巴黎;参考:01-78)。所有参与者在组织抽样之前提供了他们的书面知情同意书。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

所有作者都宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

额外的信息GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

伟德提款已成功但未到账Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

权利和权限GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料包括在文章的创作共用许可中,除非在材料的信用线中另有说明。如果材料没有包含在文章的创作共用许可证中,而您的预期使用不被法律法规允许或超过允许的使用,您将需要直接获得版权持有人的许可。如欲浏览本许可证的副本,请浏览GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba.Creative Commons公共领域奉献豁免(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据,除非另有用入数据的信用额度。GydF4y2Ba

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Santos,E.D.,Moindjie,H.,Sérazin,V.GydF4y2Baet al。GydF4y2Ba预筛因因子调节在人子宫内膜间质细胞的蜕膜中的整个脱蛋白侵袭。GydF4y2Ba天线转换开关性杂志GydF4y2Ba19,GydF4y2Ba96(2021)。https://doi.org/10.1186/s12958-021-00774-5GydF4y2Ba

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关键字GydF4y2Ba

  • 预体因子(PIF)GydF4y2Ba
  • 人类子宫内膜GydF4y2Ba
  • 蜕皮化GydF4y2Ba
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